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确诊!新型冠状病毒的检测技术详解

2020-01-31

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截至2020年1月30日23时06分,全国各省累计报告新型冠状病毒感染的肺炎确诊病例8149例,死亡病例171例,治愈出院病例135例。

确诊病例在近五日内大范围增加,让患者可以早日接受治疗,其中一个注意的因素就是新型冠状病毒检测试剂盒研发成功,挽救更多病人的生命。

中国第一批通过国家药品监督管理局批准的由上海捷诺生物科技有限公司、上海之江生物科技股份有限公司、华大基因生产的新型冠状病毒检测试剂盒获批终于问世!这也意味着针对本次疫情在病情检测和确认方面取得了重大的突破。

相信在不久之后会有更多的相关试剂盒产品获得国家的批准!从而可以最大化的提升当前医院对疑似疫情感染患者的甄别和确认工作的效率!

病毒检测分几步?总台记者深入探访武汉病毒核酸检测实验室

 

在国家卫健委于1月28日印发的《新型冠状病毒感染的肺炎治疗方案(试行第四版)》中对“确诊病例”的定义上有一条是“呼吸道标本或血液标本行实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性”。

当前卫健委指定的2019-nCoV检测第三方机构及六家核酸检测试剂盒供应商科华生物、硕世生物、西陇科学、达安基因、华大基因、之江生物所开发的检测方法均是基于荧光定量RT-PCR

RT-PCR技术的快速检测试剂盒(新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒—荧光PCR法),可实现3个小时内快速检测,能够鉴别诊断包括新冠状病毒在内的其他冠状病毒和呼吸道病原的感染,实现病毒序列快速检测。

除上述公司外,圣湘生物、辉睿生物、伯杰医疗、达安基因等多家也进入了国家药监局的快速审批通道,预计也将于近期获得正式审批。

RT-PCR技术的快速检测试剂

自新型冠状病毒2019-nCoV爆发以来,生物医药股大涨,其中硕世生物、华大基因、鲁抗医药、莱茵生物、达安基因、科华生物、西陇科学、联环药业等股票均已经涨停或接近涨停。

从病毒基因序列公布到病毒检测试剂盒刷屏,再到相应公司股票大涨,只有短短几天时间。在这一系列现象的背后,RT-PCR检测技术的应用无疑起了关键性作用。而RT-PCR技术,也成了医疗工作者们迅速查明病原的最关键技术之一。

关于什么是RT-PCR技术,它的原理是什么?以及如何使用它来诊断新型冠状病毒2019-nCoV?下面将给大家一一讲解。

什么是新型冠状病毒2019-nCoV?

这次疫情传染源是一种新型冠状病毒(2019-nCoV)),是一种正义单链RNA冠状病毒,其基因组为一条正义RNA单链。

病毒不能够独立自主的复制,只有侵染了宿主后才可以复制,该正义链进入宿主细胞后,通过依赖RNA的RNA聚合酶(RDRP)作用,生成双链,这个过程叫反转录(Reverse Transcription)。

之后双链解旋,再以负链为模板,在RDRP作用下,生成双链后再解旋,生成新的正链。这样就达到了复制的目的。后期再利用宿主的复制系统和转录系统来将自己的DNA和RNA进行复制和转录,在自己的DNA和RNA大量增加后同时还会利用宿主的翻译系统,将自己的RNA翻译成蛋白质,之后就是病毒在宿主内进行破坏正常稳态环境,使人体发生干咳、乏力、呼吸不畅、腹泻等症状。

新型冠状病毒3D影像

RNA在正常的环境中很容易被降解,导致直接对其进行检测比较困难,荧光定量RT-qPCR中的RT是英文反转录(Reverse Transcription)的首字母缩写,当前检测方法的前半部分就是借鉴了病毒劫持宿主的方式,先用反转录在体外将2019-nCoV转化成更稳定的DNA,后续再对得到的DNA进行检测。

什么是核酸检测技术?

在进行转录之前一个核心步骤是要提取基因,这个过程十分耗时,还需要专门的设备。核酸(我们常说的DNA/RNA)是核酸检测的基础物质,而核酸提取的目的都是要提取出相当纯度的核酸。

这也是整个核酸检测行业绕不过去的步骤,很多时候一份临床样本的核酸提取纯度高低,甚至直接决定了检测结果的有效性。

其实核酸提取仪就是为了减少手工提取的繁琐性和提高纯度。基本提取步骤还是和手工法一样,需要经过裂解和清洗,最后得到纯度相当的核酸。

对于核酸提取的理解,我们可以通过个形象的例子来解读,一个是我们吃核桃,裂解这一步,其实就是为了释放核酸,而把核桃敲碎暴露出核仁就相当于把细菌/病毒“敲碎”暴露出核酸。而清洗这一步,就是为了把杂质清洗干净,得到纯度相当的核酸,然后再进入实时荧光PCR仪上进行扩增。

 

核酸提取

什么是PCR技术?

诊断是否被感染的最好预期就是无论宿主内含有多少病毒都能够检测出来,PCR技术即聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),就可在试管内经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍,能够间接的提高后续检测方法的灵敏性。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术,其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应,基本原理与细胞内DNA复制相似,但反应体系相对较简单。

PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成:

(1)模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;

(2)模板DNA与引物的退火(复性):模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃ 左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

(3)引物的延伸:DNA模板–引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性–退火–延伸三过程,就可获得更多的「半保留复制链」,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

当用PCR扩增病毒DNA时并不是扩增所有的DNA序列,而是扩增所要检测病毒中特有的DNA片段,针对于2019-nCoV,用来被扩增的片段可以是新型冠状病毒的开放读码框1ab(ORF1ab)和核壳蛋白(nucleoprotein,N)基因内部的序列。

病毒的部分DNA被大量的扩增了也不用担心会对环境有太大的影响,因为这个扩增反应是在200ul的离心管管中进行的,检测后完全可以很好、很方便安全的处理掉。

当前检测方法基于荧光定量RT-PCR,上文已经介绍了RT原理和PCR技术,荧光定量又是什么技术呢?

其实就是在PCR的反应体系中添加了能够和双链DNA结合的荧光嵌入剂,当它和双链DNA结合时会发出荧光,实时荧光定量PCR仪能够实时的检测到荧光的强度。

如果荧光强度一直增加而且检测结果中是单一的峰的话说明成功的扩增了病毒的目标序列,也就是说样品里有含有病毒,可以进行进一步的测序确认。

基于荧光定量RT-PCR检测技术虽然能很好的检测新型冠状病毒,但是该技术也有些自身的缺陷,比如这种检测方法对仪器有很高的要求,一台满足要求的实时荧光定量PCR仪的价格大概在10-40多万元,普通的医疗机构很难有这样的检测设备,当遇到像这次比较重大疫情爆发,需要检测的样本量较多,而且待检样本只能集中到有限的检测机构中时问题可能就会暴露出来了,这个时候时间显得尤为重要,节约一分钟每天就可以多检测几位患者。检测仪器的有限也会导致病情鉴定速度的放缓,拖延潜在患者病情。

体外复制DNA的其它方法

既能实现反应体系中的DNA数量的迅速增加,又能规避不同温度间的精准切换这个需求,实际上有些同类型技术是可以做到的,这类技术叫做等温扩增技术,顾名思义这类技术可以在一个恒定的温度下扩增DNA。

基于等温扩增DNA的方法中有些是科学家非常聪明的设计,有些是对生物体体内DNA扩增过程的模仿。

环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术是日本学者Notomi T于2000年发明的一种新的DNA扩增技术,该方法能够高效、特异、快速的在等温条件下完成,通过一系列的链置换扩增反应,该方法能够在1h内就可以将靶基因扩增109倍,在短时间内合成上百万被检测序列。

当靶基因为RNA时,该方法还可以通过在反应体系中添加反转录酶而实现对RNA的扩增;在LAMP反应中,会有大量的DNA合成,因此会产生很多焦磷酸根离子,这些焦磷酸根离子可以结合溶液中的二价Mg2+形成不溶的焦磷酸盐,便于对反应结果的观测,使扩增和检测一步就可以完成,大大提高检测效率。

该技术根据靶基因的6个区域设计出4条引物,包括两条内引物和两条外引物,其中内引物由靶序列正义链和反义链的两个特异区域组成,利用DNA链在60-65℃的恒温条件下处于解链和退火的动态平衡状态,在DNA聚合酶的驱动下结合靶序列启动DNA合成。

由于内引物同时和双链互补,因此是形成环状结构的主要因素;外引物与内引物前端的序列互补,通过链置换DNA聚合酶的作用置换下内引物合成的DNA链并且合成自身DNA,被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换,新合成的茎-环结构的长度是原来的二倍,如此经过滚环扩增之后形成的产物是周而复始的插入靶序列的不同长度的茎-环结构的DNA链,即由很多重复的环组成的花椰菜结构。

为了提高反应速度,还可以通过引入两条环引物加快反应,环引物与合成过程中形成的环状区域互补,增加了在LAMP反应中DNA合成的起点数量,可大大缩短检测时间,提高检测效率。

LAMP技术虽然是一种新的核酸扩增技术,但其在分子生物学检测领域的应用非常广泛,相对于现有的其他核酸扩增技术,LAMP具有许多独特的优点:

(1)LAMP技术可以在等温条件下实现扩增,不需要进行模板的预变性,减少了PCR 技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求,同时扩增效率高,可以在1h内把几拷贝的目的序列迅速扩增到10 拷贝;

(2)LAMP技术分别使用一对外部引物和一对内部引物,可以识别目的序列上6个不同的区域,对目的序列具有高度的选择性,减少了非靶标序列的影响,因此扩增的特异性非常高;

(3)阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀,扩增产物的检测方法多样,可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加人染料,根据颜色的变化进行检测,还可以利用浊度仪,根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外,对于某些病原体可直接利用简单处理的样本作为模板,省略繁琐的DNA/RNA 提取步骤。

综上所述,LAMP技术因其快速、高效、特异、灵敏和经济等优点,已经应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领域,并且还将广泛应用于临床诊断、环境监测、食源安全等领域,具有更为广阔的发展应用前景。

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术

刚才提及的环介导的等温扩增尽管在主要的反应过程中只需要维持在65℃就好,但是在反应的初始阶段还是需要用高温处理一下样品,让双链DNA转化成单链DNA才能让反应开始,针对于过程能还可以再优化吗?答案是有的。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被称为是可以替代PCR的核酸检测技术,该技术可以对检测效率进一步提高。在37°C左右就可以保证实验正常进行。

RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最好反应温度在37°C左右。

RPA原理:

重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。

被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的,因为RPA引物比一般PCR引物长,通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率,影响扩增速度和检测灵敏度。

在设计RPA引物时,变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟,用户需要自己摸条件进行优化。

RPA技术有哪些优势:

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤,而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间,无需变性,在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要温控设备,RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

据介绍,RPA检测的灵敏度很高,能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平,从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理,适用于无法提取核酸的实地检测。

RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA,还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测,还可以对扩增过程进行实时监控,甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。

依赖核酸序列的扩增技术

依赖核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA),是一种扩增RNA的新技术,是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42℃进行,可以在2h左右将模板RNA扩增约10~12倍,并且不需特殊的仪器。该技术一出现就被用于疾病的快速诊断和病人血清中HIV-1的定量检测。

尽管RNA的扩增也可以使用反转录PCR技术(通过反转录形成单链DNA模板),NASBA相比则有自己的优势:可以在相对恒温的条件下进行(一般恒温为41摄氏度)。

NASBA的简要过程:

  1. RNA模板链进入反应混合物后,第一个引物首先与模板链的3’端结束,反转录酶,合成反义,补偿的DNA链

  2. RNA 酶H,分解破坏RNA模板链(仅分解与DNA杂交结合的RNA链,不分解单链RNA)

  3. 第二个引物与DNA的5’端结合

  4. T7 RNA polymerase 合成RNA补偿链,并加入到步骤1中,使反应可以循环进行。

NASBA技术已经被用于多个单链RNA基因组的病原性病毒的快速检测试验中,该技术用于医学诊断,相对传统的PCR技术更为稳定,准确。NASBA已经广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测。

总结

现在各种核酸检测技术已经有很多种,但是官方用于确诊病例的方法和指定厂家所开发的检测试剂盒的检测方法都是基于荧光定量RT-PCR,其中一个主要的原因就是要在最短的时间内开发出能大批量生产的核酸检测试剂盒,试剂盒质量的可靠性是相关机构首先应该考虑的问题,而用最成熟的技术风险最小。


开发新型核酸检测技术的生物工程师的追求是让病毒的检测变得更快、更灵敏和更便捷,更好的检测方法意味着能争取更多宝贵的时间,但更好的方法最终对现实产生实质的影响还得靠企业的衔接。

本文中所介绍的以及其它基于等温扩增的核酸检测技术综合来看不一定比荧光定量RT-PCR差,在一些方面的表现还优于荧光实时定量RT-PCR,它们在这次应对新型冠状病毒2019-nCoV的战争中没有出现一种解释是新技术还没有经受足够多的验证。

此次国家卫健委初期指定的几家试剂盒供应公司中的两家企业在病原体检测方面的产品,同类型产品基本都是基于荧光定量PCR,没有基于等温扩增的核酸检测试剂盒,说明中国相关企业对新技术还不够敏感,技术储备不够。

21世纪生物科技相关技术将会得到空前的发展,并逐渐得到商用,普及大众,随着诊断的费用越来越低,越来越方便,将会有更多便民的技术出现在我们身边。

科技在将来不仅代表着经济强盛,也可让重疾或者突发疾病得到更好的控制。最后希望武汉在这次疫情中能挺过难关,武汉加油,中国加油。在将来的科技发展中,希望国人可以更关注基础科学,前沿科技。

作者简介:

张群–高级投资经理

北方民族大学  电子信息工程

曾任职大数据公司技术岗,VIVO算法工程师。数学基础深厚,具有强的逻辑思维能力。对大数据应在医疗领域的应用有较深理解,同时对合成生物学、基因编辑领域有一定研究。

港粤资本成立于2014年,是一家专注于前沿科技在产业端应用的投资机构。公司以“基础科学驱动价值投资”为投资理念,发掘“科学企业家”,重点关注生物制药、生物技术及新材料等领域的投资机会。港粤资本下设直投、产投、跟投基金8只,致力寻找优秀的科技创新型企业,并与之共同成长。如果您是科技领域(人工智能及大数据等)的优秀创业团队,欢迎联系我们港粤资本的投资经理,期待合作,共同成长。

张群

高级投资经理

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本篇文章来源于微信公众号:%港粤资本%

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